DNA rekombinan dan teknik genetik

DNA rekombinan (atau rDNA) dibuat dengan menggabungkan DNA dari dua atau lebih sumber. Dalam prakteknya, proses ini sering melibatkan menggabungkan DNA dari organisme yang berbeda. Proses ini tergantung pada kemampuan untuk memotong dan kembali bergabung molekul DNA pada titik-titik yang diidentifikasi oleh urutan spesifik basa nukleotida yang disebut situs restriksi. Fragmen DNA dipotong keluar dari posisi normal mereka oleh enzim restriksi  dan kemudian dimasukkan ke dalam kromosom lain atau molekul DNA menggunakan enzim  ligases.

Gene Kloning

Proses menyalin fragmen DNA yang kemudian dapat digunakan untuk berbagai tujuan, seperti membuat tanaman GM, atau menemukan obat untuk penyakit. Ada dua jenis kloning gen:

1. in vivo  :  penggunaan enzim restriksi dan ligases menggunakan vektor dan kloning fragmen ke dalam sel inang
2. in vitro : menggunakan metode polymerase chain reaction (PCR) untuk membuat salinan dari fragmen DNA.

Untuk in vivo kloning fragmen DNA, yang mengandung gen tunggal atau sejumlah gen, dimasukkan ke dalam vektor yang dapat diperkuat dalam sel host lain. Sebuah vektor adalah bagian dari DNA yang dapat menggabungkan fragmen DNA lain tanpa kehilangan kemampuan untuk self-replikasi, dan vektor yang mengandung fragmen DNA tambahan dikenal sebagai vektor hybrid. Jika fragmen dari DNA mencakup satu atau lebih gen proses ini disebut sebagai kloning gen.

Ada 4 jenis yang berbeda dari vektor:

• vektor plasmid
• Lamda (λ) vektor fag
• kosmid
• vektor ekspresi

Salinan sel inang DNA kloning menggunakan mekanisme replikasi sendiri. Berbagai jenis sel yang digunakan sebagai host, termasuk bakteri, sel ragi dan sel mamalia.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Metode in vitro untuk membuat banyak salinan dari bagian tertentu DNA, tanpa perlu vektor atau sel inang. DNA yang akan disalin  (DNA template dicampur dengan primer , nukleotida, dan  polymerase DNA dikenal sebagai Taq polymerase. (Enzim ini stabil di bawah suhu tinggi, dan diperoleh dari termofilik bakteri Thermus aquaticus.) Proses ini melibatkan pengulangan tiga langkah:

• denaturasi : memisahkan dua helai nukleotida molekul DNA
• anealing     : di mana primer mengikat DNA untai tunggal
• ekstensi     : di mana nukleotida ditambahkan ke primer – di 5 ‘ke 3’  – untuk membentuk salinan untai ganda DNA target.

Setiap siklus membutuhkan waktu beberapa menit, dan siklus berulang dapat menghasilkan sejumlah besar dari urutan DNA tertentu dalam hitungan jam bukan hari. Namun, metode kloning ini tidak memerlukan pengetahuan tentang beberapa rincian tentang urutan nukleotida yang akan disalin, dan teknik yang sangat sensitif terhadap sejumlah kecil kontaminasi.

Perpustakaan gen

perpustakaan gen adalah koleksi besar urutan DNA kloning dari genom tunggal. Sebuah perpustakaan genom, (seperti dapat dilihat di atas) dalam teori, akan berisi setidaknya satu salinan dari setiap urutan genom organisme.Ini digunakan untuk menyelidiki struktur kromosom yang diberikan, atau untuk mengkloning gen tertentu. jenis perpustakaan dapat dibuat dari subset dari seluruh genom (misalnya, kromosom tunggal). Langkah pertama dalam menciptakan sebuah perpustakaan genom adalah untuk memecah, atau ‘fraksinasi’, genom menggunakan metode fisik atau enzim restriksi. Potongan tersebut kemudian dihubungkan dengan vektor yang sesuai dan kloning pada populasi sel inang yang cocok.

Sebuah perpustakaan cDNA (DNA komplementer) mengandung DNA pada populasi sel tertentu yang dibuat dari mRNA (messenger RNA) menggunakan enzim reverse transcriptase. cDNA yang dihasilkan merupakan gen diekspresikan dalam populasi sel sebagai bagian dari seluruh genom, dan dapat dikloning menggunakan vektor dan sel inang yang cocok (seperti terlihat dalam diagram di atas).CDNA tidak akan menyertakan intron atau urutan peraturan karena ini dihapus dari RNA selama pemrosesan, dan ini membuat perpustakaan cDNA lebih mudah untuk mempertahankan. Sebuah perpustakaan cDNA juga dapat disusun dengan menggunakan reverse  transcriptase PCR (RT-PCR).

Identifikasi Gen Produk di Perpustakaan Gene

Enzim restriksi (untuk memotong DNA) dan elektroforesis gel (untuk memisahkan fragmen yang dihasilkan) dapat digunakan untuk menghasilkan peta fisik segmen DNA dalam proses yang dikenal sebagai pemetaan pembatasan. Sebuah contoh dari apa salah satu dari ini mungkin terlihat seperti dapat dilihat di bawah ini.

Ada juga sejumlah teknik yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi gen-gen tertentu atau produk gen dalam perpustakaan gen dan ini adalah: Southern blotting, blotting Utara dan Western blotting. Namun, teknik eksperimental yang paling kuat untuk menyelidiki genetika pada tingkat molekuler adalah sequencing DNA, yang memungkinkan urutan nukleotida gen – bahkan seluruh kromosom – yang akan ditentukan. teknologi sequencing otomatis sekarang memungkinkan kita untuk urutan seluruh genom dari organisme dari bakteri ke manusia.

Genetika Molekuler dan Bioteknologi

Teknik-teknik baru dari genetika molekuler, dikombinasikan dengan perkembangan bioteknologi terkait, telah menyebabkan kemajuan di sejumlah bidang yang berbeda. Kita sekarang dapat menganalisis genom spesies yang membuat kontribusi penting untuk pertanian, produksi bahan bakar atau pengembangan obat. Kita bisa memindahkan gen dari satu organisme ke organisme lain untuk membuat tanaman transgenik dan hewan, dan menggunakan teknik kloning hewan untuk menghasilkan hewan yang secara genetik identik, seperti domba Dolly, dan baru-baru, binatang kloning seperti kucing dan anjing.

Proses kloning sangat mudah, tetapi hasilnya tidak selalu dapat diprediksi. Butuh ratusan upaya untuk mendapatkannya bekerja dan menghasilkan satu domba hidup, dan kloning itu sendiri menimbulkan banyak pertanyaan tidak hanya tentang manfaat dan risiko, tetapi juga banyak pertanyaan etis. Teknik sidik jari genetik, yang memungkinkan identifikasi individu dan hubungan antara individu telah menemukan banyak aplikasi dalam ilmu hari ini. Ada juga penelitian yang sedang berlangsung dalam terapi gen yang mengkaji kemungkinan memperkenalkan gen kloning untuk mengkompensasi cacat, gen mutan. Dan daerah lain, misalnya, kloning manusia dan penelitian sel induk membuka banyak masalah etika yang harus dibenahi bersama perkembangan ilmiah.

Sumber: www2.le.ac.uk/departments/genetics/vgec/highereducation/topics/recombinanttechnique