Biozatix News – Informasi Popular Sains Teknologi dan Kedokteran
Western blot yang baik membutuhkan waktu, usaha dan reagen yang benar. Perhatian terhadap detail adalah kunci untuk hasil yang memuaskan. Kelima tips berikut ini dapat membantu menghilangkan perangkap yang dapat merusak hasil kerja keras anda.
1# Optimalkan Blocking buffer
Saat ini tersedia blocking reagent dengan berbagai sumber dan tipe untuk aplikasi Western blot. Kinerja antibodi dapat membahayakan dengan memilih blocking reagent yang berkualitas rendah. Blocking reagent berbahan dasar susu kemungkinan mengandung IgG yang dapat menyebabkan reaksi silang dengan antibodi bersumber goat. Hal tersebut secara signifikan meningkatkan background/latar belakang dan mengurangi sensitifitas. Blocking reagent berbahan dasar susu juga mungkin mengandung biotin endogenus atau phosphor-epitop yang dapat menyebabkan kontaminasi background yang tinggi. BSA (Bovine Serum Albumin) merupakan alternatif yang lebih baik untuk deteksi phosphor-protein, deteksi menggunakan alkalin fosfatase dan untuk deteksi sitem avidin/biotin.
Deteksi chemiluminescence penting dilakukan untuk menghindari blocking buffer yang mengandung azide, yang dapat mengganggu reaksi enzim HRP.
2# deterjen
Penambahan deterjen untuk mengencerkan antibodi dapat secara signifikan mengurangi background pada western blot. Konsentrasi deterjen yang optimal sangat bervariasi, tergantung dari jenis antibodi, tipe membran, dan blocking reagent. Perlu diingat bahwa antibodi primer memiliki perbedaan afinitas pengikatan dan mungkin akan tercuci dengan adanya penambahan deterjen yang terlalu banyak. Hindari paparan deterjen pada membran sampai proses blocking selesai, jika terjadi maka akan menyebabkan peningkatan background.
Pengencer untuk antibodi primer dan sekunder seharusnya memiliki konsentrasi tween20 sekitar 0.1-0.2% untuk membran nitroselulosa dan 0.1% untuk membran PVDF. Konsentrasi Tween20 yang lebih tinggi akan meningkatkan background pada PVDF. Ketika menggunakan membran PVDF untuk deteksi fluoresen, pengencer antibodi sekunder seharusnya memiliki konsentrasi SDS antara 0.01 sampai 0.02%. SDS dapat juga ditambahkan pada pengencer antibodi ketika menggunakan nitroselulosa untuk mengurangi background keseluruhan secara dramatis dan untuk mengurangi atau meminimalisir penempelan nonspesifik. Penting untuk diketahui bahwa SDS adalah deterjen ionik dan dapat mengganggu interaksi antigen-antibodi selama proses deteksi ketika konsentrasinya terlalu tinggi.
3# antibodi primer
Antibodi primer dapat diproduksi pada berbagai spesies sama halnya antibodi monoklonal pada tikus dan kelinci atau sebagai antibodi poliklonal pada tikus, kelinci, kambing (mice, rabbits, goats) rats, guinea pigs, ayam, manusia dan lainnya. Antibodi primer berbeda jenis yang diproduksi untuk mendeteksi antigen yang sama, dapat menghasilkan hasil yang sangat berbeda. Antibodi tersebut mungkin dibutuhkan untuk tes multiple antibodi primer, optimasi diperlukan untuk mendapatkan hasil hasil western blot yang optimal.
Sumber: http://www.genengnews.com/experttips/5-tips-for-your-best-western-blots/4719